引言
卡纳万病(CD)是一种罕见的疾病，这种疾病是由aspA基因突变引起的，该基因编码了天冬氨酸酰基酶(ASPA)。这些突变导致氨基酸取代，产生突变酶异构体的表达，从而导致了酶的不稳定或催化活性降低，导致关键脑代谢物N-乙酰-l-天门冬氨酸(NAA)的积累，并导致了少突胶质细胞中醋酸盐的生产不足，从而会导致脂肪酸生物合成的减少和神经元的脱髓鞘。截至目前，由于缺乏有效的治疗方法，CD仍然是一个致命并且无法治愈的疾病。
先睹为快
作者信息
美国加州旧金山Atomwise公司、美国俄亥俄州托莱多大学化学与生物化学系
AdrianStecula、RonaldE.Viola
靶点
天冬氨酸N-乙酰转移酶ANAT
计算方法
同源模建，深度卷积神经网络AtomNet
计算流程
研究者基于低蛋白质序列同源性“模糊区域”的模板结构生成了同源模建模型，随后筛选了商业化合物库Mcule（约万化合物）。去除分子量在-以外的，手性超过7个，以及可旋转键大于16的分子，然后利用RDKit中的PAINS进行过滤，剩下分子经过AtomNet(深度卷积神经网络)打分，打分前的分子，选择分子量大于，并且不含对特定基团的化合物，随后进行结构聚类，选择个代表性化合物，随后在MolSoftICM软件中，按照molecularweightDa,logP7,PAINSscore0.6,toxicologyscore2.5,“badgroups”=none进行过滤，选择打分前个化合物进行购买，其中60个化合物在DMSO中具有较好的溶解性，选择这60个化合物进行实验验证高置信度预测的结合物的体外测试，从中发现了靶向ANAT的类药性小分子抑制剂。
过去几十年里，绝大多数针对CD的治疗方法的研究都集中在ASPA上。ASPA是一种有缺陷的酶，专门负责将NAA代谢成大脑中的天冬氨酸和醋酸盐。最近的研究提供了令人信服的证据，证明导致CD症状的主要原因是脑内NAA水平升高，而不是无法产生下游代谢物。脑内NAA的合成是由nat8l基因编码的天冬氨酸N-乙酰转移酶(ANAT)催化的(图1A)。敲除nat8l基因可以消除作为CD标志的大脑缺陷。免疫组织学和TEM成像显示，没有证据表明CD中存在广泛的空泡化和脱髓鞘，NAA水平的降低减少了大脑皮层和小脑区域神经元的损失。尽管这些动物将NAA代谢成天冬氨酸和乙酸盐的能力减弱，但发育缺陷的消除仍然发生，这是代谢的结果，也是大多数CD治疗研究的焦点。通过降低NAA水平，不仅可以消除这些发育缺陷，而且行为和表现评估表明，与受损的卡纳万小鼠模型相比，这些缺陷有显著改善。
图1脑内NAA的代谢及同源模建构建的人ANAT模型
图片来源JMC
当前，阻碍进一步研究CD患者NAA水平下降的影响的一个关键问题，是无法获得ANAT和缺少工具化合物来探究这一途径。与此同时，目前市场上还没有FDA批准的ANAT抑制剂。目前已知的抑制剂是通过片段库筛选确定的，随后迭代优化产生该酶的第一个有效抑制剂。但由于细胞通透性和潜在毒性，临床上并不受欢迎。在这里，研究者描述了一个新的方法可用于ANAT的靶向识别。研究者基于低于蛋白质序列同源性“模糊区域”的模板结构生成了一个比较结构模型，随后使用AtomNet(深度卷积神经网络模型)筛选了包含近万化合物的现成商业化合物库。经过体外测试发现了靶向ANAT的一类小分子抑制剂。
AtomNet训练
AtomNet是第一个用于基于结构的药物发现的深度神经网络。使用几百万个小分子的生物活性值(例如Ki或IC50)和几千个不同家族的蛋白质结构，以此训练形成一个单一的全局AtomNet模型，用来预测结合亲和力。
训练过程如下：
1.使用基于初始起始点的泛洪算法在给定的蛋白质结构上定义结合位点。可以通过多种方法来确定，包括RCSBPDB数据库中标注的结合配体，诱变研究中发现的关键残基，或文献中报道的催化基序的鉴定。
2.将共复合物的坐标转换为以结合点的质心为原点的三维笛卡尔坐标系。然后，通过围绕结合位点的质心随机旋转和翻译蛋白质来进行数据增强。
3.随后，对于一个给定的配体，研究者在结合位点腔内对多个姿态进行采样。每一个姿态都代表一个假定的协复合体，因此，与以往基于结构的预测方法(如对接)不同，该方法不需要实验协复合体来进行训练或预测。
4.然后将生成的每个共复合物栅格化为固定大小的规则三维网格，其中每个网格点上的值表示每个网格点上存在的结构特征，不同网格点表示不同的原子类型(或更复杂的蛋白质配体描述符，如SPLIF、SIFt以及APIF等)。这些网格作为卷积神经网络的输入，定义了网络的接受域。研究者采用了一种输入层间距为1的30×30×30网格的网络架构，随后是六个依次是32×33,64×33,64×33,64×33,64×33,32×23（(滤芯数量×滤芯尺寸)的卷积层，最后是一个全链接层以及ReLU激活单位。每个姿态的得分会通过一个加权的波尔兹曼平均值进行组合，这个加权平均值会根据他们的预测得分对姿态进行加权。然后将这些分数与实验测量的蛋白质和配体对的活性等级进行比较，并用二元交叉熵损失函数调整神经网络的权重以减少预测和实验测量的亲和力之间的误差。使用ADAM自适应学习方法、反向传播算法和每梯度步长64个生物活性目标化合物对的小批量进行训练。
预测遵循一个类似的过程。研究者在靶蛋白上选择一个正位或变位结合位点。接下来，对于给定的感兴趣的分子筛选库中的每个分子，生成一组结合位点内的位姿。每一个都由训练过的模型打分，分子列表也根据它们的分数进行排序。然后，根据标准化的过滤协议、供应商的可用性和价格，研究者购买列表顶端的一组分子进行了实验测试。该操作不会通过对化合物的视觉检查而引入人工偏差。
同源模建
在项目开始的时候，还没有公开的人类ANAT蛋白的结构。研究者使用SWISS-MODEL对模板结构的搜索表明，序列识别范围在9%(PDB编码4RI1)到25%(PDB编码3PP9)之间存在许多同源结构。经过大量的分析研究，最终，研究者选择PDBcode5T7E作为比较结构建模的模板，原因是结构中存在底物以及两种蛋白的催化活性相似(图1B)。人类天冬氨酸N-乙酰转移酶依赖乙酰辅酶A作为乙酰基供体来执行其催化功能。该酶的催化区域预测为假设常见的Gcn5相关N-乙酰转移酶(GNAT)折叠。利用PROMALS3D构建目标模板序列比对。对比结构模型在MolsoftICM3.8中使用完整的模型构建器模块和完整的优化例程中建立而成，保留辅酶A和L-草丁膦分子作为刚体。人工检查模型，确保侧链原子没有缺失时，添加氢，将辅酶A分子替换为PDBcode5T7D的乙酰辅酶A。以L-草丁膦分子为起始点，采用泛洪算法确定筛选位点。
虚拟筛选过程
从一家化学品供应商(Mcule,